HPV nin Tanısı 1

[drmedusa]

HPV infeksiyonlarının çoğu klinik belirti vermez; latent veya subklinik
infeksiyonlar daha yaygındır. Bu sebeple en çok virolojik tanı yöntemleri
kullanılır.
HPV, hücre kültürü veya laboratuvar hayvanlarında üretilemez .
Cinse özgül antiserum kullanılarak doku veya yayma örneklerinde HPV
ile olan produktif viral infeksiyon, immunolojik bir test ile saptanabilir. EM
yöntemi ile virusun veya infekte dokuda in situ hibridizasyon ( ISH )
yöntemiyle viral DNA’nın gösterilmesiyle tanı gerçekleştirilebilir. Ancak özgül
bir HPV tipinin laboratuvar tanısı, nükleik asit çalışmalarının yapılmasını
gerektirir
Morfolojik Tanı
HPV infeksiyonunun muhtemel tanısı mikroskobik olarak histolojik
muayenede koikilositozun gösterilmesi ile konabilir. Viral infeksiyonun varlığını
gösteren sitolojik değişikliklerin Papanicolau boyası ile saptanması
servikovaginal hücrelerde tarama amacı ile bugün kullanılmaktadır. . Dr.
Papanicolau tarafından ortaya atılan bu yöntem kısaca Pap smear olarak
bilinmektedir. Ancak duyarlılığı düşük olduğundan kesin tanı için immunolojik
veya nükleik asit tanı yöntemleri kullanılmaktadır .
Viral Proteinlerin Saptanması
Doku kesitleri veya sürüntü örneklerinde bütün tipler arasında çapraz
reaksiyon veren cinse özgü antiserum kullanılarak herhangi bir immunolojik
yöntem ile Papillomavirus kapsid antijenleri saptanabilir. Bu testler sadece
produktif infeksiyonu saptamada kullanılır, viral partikülllerin EM ile
incelemesinden daha hassas olmasına rağmen yine de yeterince sensitiv
değildir.
Antiserum bütün HPV tipleri ile çapraz reaksiyon verdiği için, pozitif
reaksiyon HPV tipini göstermez. Ayrıca negatif sonuç da HPV infeksiyonunu
ekarte ettirmez, çünkü kapsid antijeni, histolojik olarak verruka tanısı almış
örneklerde her zaman aynı şekilde eksprese olmaz fakat HPV cevabı oluşur.
HPV tip spesifik IgG antikor pozitifliği yıllarca persiste edebilir. Bu yüzden
serolojik testler akut ve geçirilmiş infeksiyonları ayırt etmek için uygun değildir
.
Viral Nükleik Asit Saptanması
Geçirilmiş veya geçirilmekte olan HPV infeksiyonunun ayırıcı tanısında
güvenilir bir serolojik test olmaması ve virus izolasyonunun yapılamaması
nedeni ile kesin tanı HPV DNA’sının örnekte gösterilmesine dayanmaktadır.
HPV infeksiyonun tanısında kullanılan moleküler tanı testleri üç grupta
incelenebilir.
1) Hibridizasyon testleri : ISH , southern blot hibridizasyon ( SBH ), dot blot
hibridizasyon ( DBH ) ve filter in situ hibridizasyon ( FISH )
2) Hybrid Capture testi ( HC, Hibrid yakalama testi ) : Sinyal amplifikasyon
kullanılarak yapılan direkt DNA testi
3) Polimeraz zincir reaksiyonu ( Polymerase chain reaction; PCR ) : DNA
amplifikasyon testi

HPV’nin tanı metotları arasında PCR en duyarlı metoddur ve referans
test olarak kabul edilir PCR ve HC tanıda en çok kullanılan testlerdir.
1) Hibridizasyon testleri : HPV tanısı için ilk çalışmalarda kullanılmıştır.
İSH ile HPV, direkt olarak hücre ve biyopsi örneklerinde tespit edilir. Bu metod
intraselüler HPV DNA ile hibridize olan spesifik probların kullanımına dayanır.
Bu test ile virusun hücredeki lokalizasyonu; hücrede integre veya epizomal
halde bulunup bulunmadığı tespit edilebilir. SBH testi PCR ile kıyaslandığında
spesifitesi ve sensitivitesi daha düşüktür. Ayrıca bu yöntem fazla miktarda doku
gerektirmektedir ve fikse ederek saklanmış doku örneklerinde DNA’nın kırılması
nedeniyle uygun değildir. Alternatif olarak HPV DNA, DBH , FISH ile tespit
edilebilir. Bu testler genellikle araştırma amacıyla kullanılır, yapılması yorucu ve
zaman alıcıdır. Fazla sayıda örneğin incelenmesi için uygun değildir, rutin
olarak kullanılamaz .
2) Hybrid Capture testi : HC I ( Digene ) ve HC II ( Digene ) olmak
üzere iki tipi mevcuttur. Hybrid Capture Tube Test olarak da bilinen HC I
testi tüpte yapılan non-radyoaktif sinyal amplifikasyon metodudur. Bu test ile 5
LR HPV ve 9 HR HPV tipi tanınmaktadır. Cut off değeri 10 pg HPV DNA /ml’dir.
HC II ise HC I’in mikroplak formatında geliştirilmiş versiyonu olup HR HPV tip
sayısı 13’e yükseltilmiştir. Cut off değeri 1 pg HPV DNA/ml’dir. HC II testi, HC
I’e göre 10 kez daha yüksek sensitiviteye sahiptir, spesifitesi de artmıştır. HC II
testi servikal hücrelerin HPV testi için FDA’den onay alan tek metoddur. HC II
testi örnekteki hedef HPV DNA ‘nın spesifik RNA problarıyla solüsyon fazda
hibridizasyonuna dayanır. HC II test sisteminde servikal kanserde en sık
bulunan 13 yüksek risk ve beş düşük risk HPV tipinin genomik sırasına
komplementer RNA probları kullanılır ki bu spesifik RNA probları yüksek risk tip
prob kokteyl ve ve düşük risk prob kokteyl formatında hazırlanmıştır . İki farklı
RNA prob kokteyli deneyde ayrı ayrı kullanılır ve böylece test, örnekteki HPV
DNA‘nın sadece düşük veya yüksek risk grubunda olduğu hakkında bilgi
verir, ancak spesifik HPV genotipi hakkında bilgi vermez (23,26 ).
HC II testinde, serviksten alınan hücreler transport besiyerine alınır. Sonra
DNA denatüre edilerek tek sarmallı hale getirilir ve hasta örneğindeki tek
sarmallı hedef HPV DNA, yüksek ve düşük risk RNA prob kokteyl ile ayrı ayrı
inkübe edilerek DNA-RNA hibridizasyonu gerçekleşir. Oluşan bu hibridler DNARNA’ya
karşı spesifik antikorlarla kaplı mikroplağa transfer edilir. Mikroplak
kuyularına bağlı antikorlar tarafından yakalanan hibridler daha sonra ilave
edilen alkalen fosfataz ile konjuge anti-hibrid antikorlarına bağlanır. Fazla
antikorlar ve hibridize olmamış problar yıkama ile uzaklaştırılır ve kalan
hibridler, alkalen fosfataz enzimi ile reaksiyona giren kemiluminesan subsrat
ilavesi ile oluşan ışık sonucu tespit edilir. Yayılan ışık miktarı luminometrede
ölçülür ve her örnek tarafından oluşturulan ışık miktarı testteki üç kalibratörün
yaydığı ışık miktarının ortalamasına bölünmesi ile elde edilen oran olan relative
light unit ( RLU ) olarak ifade edilir ve örnekteki mevcut hedef DNA miktarı ile
orantılıdır . HC II testi viral yükün semikantitatif ölçümünü sağlar. Pozitif
sonuçlar için FDA’in tavsiye ettiği cut off değeri 1.0 RLU’dur ve 1pg HPV
DNA/ml veya 5000 genoma eşdeğerdir ve bu değerden yüksek bulunan
örnekler pozitif kabul edilir. HSIL tespitinde histolojik tanı referans test olarak
dikkate alındığında HC II testinin sensitivitesi , % 84 ile %100 arasında,
spesifitesi, % 85-89 arasında değişmektedir . HC II testi bir çok ülkede
klinik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Klinik değerlendirmede
sadece yüksek risk prob kokteylinin kullanılması test süresini ve maliyetini
azaltır. HC II testinin 96 kuyucuklu mikroplak formatında olması otomasyon için
uygundur. HC II testi PCR gibi hedef amplifikasyonuna dayanmadığından kros
kontaminasyon riski düşüktür.
Yeni prototip Hybrid Capture III ( Digene ) testi geliştirilmiştir. HC II testine
benzer ve HPV DNA ile hibride olan aynı RNA probları kullanılır. Ancak HC
II’ye göre daha sensitiv bulunmuştur, çünkü DNA-RNA hibridlerini yakalamak
için HC II testindeki anti DNA-RNA antikorları yerine strepavidin ile kaplı
kuyucukları olan mikrotitrasyon plağı kullanılır.

Yard.Doç.Dr Levent TÜRK (Dr. Medusa) Muayehane: Küçük Langa Caddesi, No:30 – 12 YENİKAPI/ İSTANBUL 0505 600 40 10 – 0212 586 81 80 Mail: drleventturk@gmail.com