3) PCR : En yaygın kullanılan hedef amplifikasyon metodudur. Servikal
hücrelerin HPV analizi için araştırmalarda çok yaygın kullanılmasına rağmen
laboratuvarlar arasında standardizasyonu yoktur. PCR testinin spesifitesi ve
sensitivitesi PCR ürünlerinin uzunluğu, reaksiyonda kullanılan DNA polimeraz
performansı, kullanılan primer seti ve reaksiyon şartları gibi faktörlere
dayanarak değişir. PCR ile HPV DNA amplifikasyonu için çeşitli konsensus
primer sistemleri mevcuttur. Konsensus PCR primerler ile geniş spektrumda
farklı HPV genotipleri amplifiye edilebilir. En çok seçilen protokol, HPV
genomunun son derece korunan bölgesi L1 genini hedef alan konsensus veya
genel primerlerin kullanımıdır ve hemen hemen bütün mukozal HPV tipleri tespit
edilebilir. E1 bölgesinden genel primerler ile bir çok geniş spektrumlu diğer
PCR primerleri bildirilmiştir, fakat yaygın kullanılmamaktadır. HPV genomunun
L1 bölgesine yönelik en yaygın kullanılan konsensus primer setleri MY09/11 ve
modifiye versiyonu PGMY09/MY11, GP5/GP6 ve daha uzun versiyonu GP5+/
GP6+ ve SFP primerleridir. MY09/MY11 primerleri L1’e ait 450bp, GP5/GP6
primerleri 150bp ve SFP primerleri 65 bp’lik bölgeyi hedef alır ( 23,28 ).
HPV PCR amplifikasyon ürünleri analizi: Konsensus HPV primerleri ile
yapılan PCR testi sonucu HPV pozitif bulunan örneklerde daha sonra spesifik
HPV tipinin tespiti için hibridizasyon, dizi analizi , RFLP (restriction fragment
length polimorphism ) ve tip spesifik PCR ( TS – PCR ) gibi bir çok testler
kullanılır.Ancak servikal mukozayı infekte eden 40’tan fazla HPV tipi
bulunduğundan, genotip tayini için her örneğe çok sayıda SBH hibridizasyon
testi veya tip spesifik PCR testinin ayrı ayrı yapılması gereklidir. Bu işlem
zaman alıcı ve yorucu olduğundan rutin uygulama için uygun değildir. Bu
sebeple PCR amplifikasyonundan sonra HPV tiplerinin tanısı için mikroplakta
hibridizasyon ( PCR – ELİSA ) ve Line Prob Assay ( LİPA ) gibi alternatif
genotipleme sistemleri geliştirilmiştir. Konsensus primerleri HPV varlığını tespit
eder ve PCR ürünlerinin tip spesifik problarla hibridizasyonu ile en az 40 kadar
HPV tipinin ayrımı yapılabilir. HPV genotiplemesi için revers line bloth
hibridizasyon assay olarak da bilinen LİPA, naylon strip veya nitrosellüloz
membran üzerine immobilize olmuş spesifik DNA problarıyla amplikonun
hibridizasyonuna dayanarak yapılır. Hibridizasyonu tespit için PCR
amplifikasyonu biyotin ile işaretli primerlerle yapılır. Biyotinli amplikon, strip
üzerindeki spesifik prob ile hiridize olur. Sonra amplikon varlığı alkalen fosfataz
ile işaretli strepavidin konjugat ile tespit edilir; strepavidin amplikon üzerindeki
biyotine bağlanır. Alkalen fosfataz , substrat ilavesi ile renk oluşumunu katalize
eder ve amplikonun spesifik probla hibridize olduğu yerde renkli çizgi oluşur.
Mikroplak hibridizasyonu ( PCR- ELİSA ) ile amplikon tespiti için PCR
amplikonu yine biyotinle işaretli primerler kullanılarak yapılır. Böylece biyotinli
PCR ürünleri mikroplağın strepavidin kaplı kuyularında yakalanır. Plak yıkanır
ve yakalanan DNA, alkalin uygulaması ile denatüre edilir. Ardından amplikon,
ilave edilen digoksigenin işaretli spesifik HPV probları ile hibridize olur. Daha
sonra hibridler digoksigenine bağlanan alkalen fosfataz ile konjuge antidigoksigenin
ve substrat ile reaksiyon sonucu gelişen rengin gözlenmesiyle
tespit edilerek test sonuçları değerlendirilir . HPV DNA tespiti için
yakınlarda geliştirilen yeni bir sistem Roche Amplicor HPV microtiter well plate
( MWP ) mikroplak hibridizasyon metodudur. Bu metod HPV L1 geninin 170
bp’lik kısa bir bölgesinin hedefleyen geniş spektrumlu PCR ile sadece 13
yüksek riskli HPV genotipinin tespitine dayanır ayrıca araştırma amaçlı
kullanılan DNA mikro array testler ile çok sayıda HPV tipinin viral yük analizi ve
tiplendirilmesi yapılabilir. Servikal kanser için risk altında olanların tanısı için
HPV viral yük ölçümü ve multiple infeksiyonların tespiti ve yardımcı test olarak
telomeraz aktivitesinin tespiti gibi testlerin kullanımı da araştırılmaktadır (23).
Prekanseröz lezyonların gelişmesi ve servikal kansere progresyon riskini
değerlendirmek için yüksek risk HPV 16 ve 18 tiplerinin E6/E7 onkogen
transkriptlerinin revers-transkriptaz PCR ( RT- PCR ) ile tespiti özellikle HR
HPV ile infekte displazisi olmayan hastalar ve hafif displazisi olan ( CIN I )
hastalarda faydalı olabilir. İnvaziv servikal kanserin nedenin HR HPV tarafından
ürtilen E6/E7 mRNA’dan translasyon sonucu oluşan E6/E7 proteinleri olduğu
bilindiğinden mRNA’yı saptamaya yarayan yöntemlerin gelecekte daha yaygın
olarak kullanılacağı öngörülmektedir. E6/E7 transkriptlerin tespitinin lezyonun
ciddiyeti ile korele olduğu bir çok çalışmada gösterilmiştir. Şimdilik ticari olarak
mevcut tek RNA bazlı HPV testi Pre Tect HPV-Proofer ( Norchip AS ,Norway )
olup RNA E6/ E7 transkriptlerinin real-time NASBA ( nükleic acid sequence –
based amplification ) ile amplifikasyonuna dayanır .

HPV Testinin Kullanımı
HPV testinin başlıca üç kullanım alanı vardır.
1) Servikal kanser taramasında 30 yaşın üstündeki kadınlarda Pap
smear testi ile birlikte kullanımı
2) AS-CUS ( Atypical squamous cells of undetermined significance ) tanısı
alan kadınların yönlendirilmesinde
3) Tedavi sonrası kadınların takibinde
Servikal prekanseröz lezyonları tespit etmede HPV DNA testinin
sensitivitesi, (% 84–100 ) Pap smearden daha yüksektir. Fakat spesifitesi % 64-
95 olup daha düşüktür. Pap testinin yüksek grade lezyonların tespiti için
sensitivitesi % 55-70 arasında olmasına rağmen spesifitesi % 90’ın üzerindedir.
Servikal prekanseröz lezyonların tanısı için sitolojik tarama ve HPV DNA
23
analizini kombine eden yeni algoritmler geliştirilmiştir. Ayrıca HPV testi ile
terapötik ( tedavi edici ) ve profilaktik ( koruyucu ) immunizasyon için seçilecek
grupları tanımak mümkündür. Persistan HR HPV infeksiyonu olan kadınların en
az % 50’sinde HSIL gelişir. HR HPV testinin 30 yaş üstü kadınlara yapılması ile
risk altındakiler erken tanınır. HR HPV testini 30 yaş altındaki kadınlarda
yapılmasının – bu grupta HPV infeksiyonları geçicidir – klinik önemi pek yoktur.
HPV testinin servikal kanser taramasında kullanımı önemlidir çünkü; normal
Pap smear ve negatif HPV DNA testinin negatif prediktif değeri % 99-100’dür.
Bu kadınlarda tarama aralığı üç yıla çıkarılabilir.
ASCUS raporu olan vakalara uygulanacak üç seçenek vardır; 4-6 ay
sonra Pap testi tekrarı, hemen kolposkopi veya HPV DNA testi. ASCUS raporu
olan vakaların % 80’i normal servikal sitolojiye sahiptir. ASCUS tanısı alan
kadınların % 5-17’sinde HSIL mevcuttur. Bu gruba HR HPV testinin yapılması
ile sadece HR HPV pozitif bulunanlara kolposkopi yapılır. ASCUS grubunda HR
HPV test sonucunun pozitifliği HSIL varlığı ile son derece korele olup sensitivite
% 95’tir. ASCUS pozitif iken HR HPV negatif ise 6-12 ay sonra test tekrarlanır,
pozitif sonuç alınırsa kolposkopi ve gerekirse tedavi edilirler. Servikal sitoloji
normal ama HR HPV DNA pozitif ise, 6-12 ay sonra her iki test de tekrarlanır.
Tekrar yapılan test sonucu persistan HR HPV infeksiyonu pozitif ise yada
sitolojik test pozitif ise kolposkopi yapılır.
Prekanseröz lezyonlar için tedavi edilen hastaların takibinde de HPV testi
kullanılabilir. Rezidüel ya da rekürren prekanseröz lezyonların gelişme sıklığı
% 5-10 arasında değişir. Tedavi yapılan hastaların takibinde 6-12, ay sonra
sitoloji yanısıra HPV DNA testinin yapılması önerilmektedir

Yard.Doç.Dr Levent TÜRK (Dr. Medusa) Muayehane: Küçük Langa Caddesi, No:30 – 12 YENİKAPI/ İSTANBUL 0505 600 40 10 – 0212 586 81 80 Mail: drleventturk@gmail.com